La préparation d’échantillons à partir de quelques cellules et leur analyse constituent un défis pour la biologie actuelle. De nombreux points restent critiques comme l'extraction des ARNm et leur analyse par qRT-PCR. De plus, il n'existe encore pas à ce jour de microsystèmes réalisant des protocoles complets sur une même puce.

Le laboratoire et le Département micro-Technologies pour la Biologie et la Santé du Leti, et plus particulièrement le Service Bio-System on Chip, développent en collaboration un lab on a chip intégré et automatisé permettant de réaliser de tels protocoles complets sur une seule puce. Le DTBS apporte son expérience de plusieurs années sur de tels systèmes, et le laboratoire Biopuces son expertise en biologie.

Ce microsystème (Figure 1A), entièrement fabriqué dans les salles blanches de microélectronique du Leti, est une puce de silicium de 2 cm de côté sur laquelle est déposé un réseau d'électrodes métalliques. L'ensemble, recouvert d'une couche hydrophobe, est basé sur la technologie EWOD^[1] permettant la manipulation de gouttelettes de quelques dizaines de nanolitres de manière discrète (microfluidique en goutte) par application d'un champ électrique à travers ces électrodes. Toutes les opérations ^[2] basiques sont envisageables : dispense de gouttes depuis un réservoir (Figure 1B), déplacement et coalescence de ces gouttes afin de les mélanger ou de faire des dilutions… Ces gouttes deviennent alors des microréacteurs dans lesquelles il devient possible de réaliser toute sorte de protocoles biologiques. L'intérêt d'un tel système est de pouvoir manipuler des volumes de quelques dizaines de nanolitres et plus particulièrement des échantillons précieux, impossibles à manipuler avec des outils classiques. La réalisation de plusieurs analyses en parallèle devient également envisageable alors que dans un tube il n'est possible d'en faire qu'une, voire aucune.

La puce dédiée à ce projet permet la manipulation et la sélection de cellules uniques (Figure 1C), leur lyse, la capture des ARNm par billes magnétiques fonctionnalisées et leur analyse par qRT-PCR. Cette puce est contrôlée par un banc dédié incluant le chauffage des cycles PCR, un aimant pour la manipulation des billes magnétiques, et une caméra pour la visualisation des gouttes ainsi que le suivi par fluorescence de la réaction de PCR.

Le laboratoire LFCM du DTBS a validé toutes les étapes du protocole (Figure 2) de façon indépendante par comparaison avec des expériences réalisées en tube.

Ces chercheurs ont montré que les réactions de qRT-PCR (Figure 3) réalisées à partir de l'équivalent en ARNm du contenu de quelques cellules sont possibles dans ces gouttes de 64 nl.

Ils ont d'ores et déjà validé le protocole complet sur une puce unique, ceci pour une vingtaine de cellules ^[3] et leurs résultats montrent que le travail sur cellule unique est à leur portée.

Un tel système apporte de nouvelles solutions pour manipuler de petits volumes et de petits échantillons dans le cadre de protocoles complexes de biologie. Une telle technologie a des applications dans le domaine de la recherche fondamentale mais aussi en diagnostique médical et à plus long terme, le point of care. Ces chercheurs appliqueront cette approche à l’étude des changements d’expression associés à la déprogrammation des iPS (induced Pluripotent Stem Cells).