Vous êtes ici : Accueil > Le laboratoire > Identification et caractérisation des protéines présentes dans les compartiments subcellulaires impliqués dans le processus d'endocytose chez l'amibe Dictyostelium discoideum

Céline Adessi

Identification et caractérisation des protéines présentes dans les compartiments subcellulaires impliqués dans le processus d'endocytose chez l'amibe Dictyostelium discoideum

Publié le 14 novembre 1996
Thèse soutenue le 14 novembre 1996 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Joseph Fourier de Grenoble I - Spécialité : Biologie

Résumé :
L'endocytose est le terme employé pour définir le processus biologique qui permet à une cellule d'internaliser du matériel extra-cellulaire dans des vésicules dérivées de sa propre membrane plasmique. L'amibe Dictyostelium discoideum est un modèle particulièrement adapté à ce type d'étude puisque c'est par l'endocytose qu'elle assure sa fonction vitale de nutrition. À ce jour, certaines protéines jouant un rôle dans le trafic endocytaire ont déjà été caractérisées. Mais cette liste est loin d'être exhaustive. Mon travail de thèse a consisté à purifier le compartiment endocytaire de l'amibe afin de caractériser et identifier les protéines qui lui sont associées. L'obtention de matériel de très grande pureté reste une difficulté majeure pour l'étude des protéines associées aux compartiments subcellulaires. Une technique, appelée fractionnement magnétique, a été adaptée de la littérature afin d'isoler des vésicules d'endocytose de très grande pureté. Les protéines associées à ces vésicules sont peu abondantes puisqu'elles représentent au total moins de 1 % (masse/masse) des protéines totales de la cellule. Une analyse par électrophorèse sur gel d'acrylamide révèle la présence d'au moins une centaine de protéines. Des séquences protéiques partielles ont été obtenues par microséquençage à partir d'une vingtaine de protéines majeures. Parmi celles-ci, une recherche d'homologie de séquence dans les banques de donnés a permis d'identifier et parfois de donner les premières informations de séquences sur :
Une protéine de la famille des petites protéines G (rab7) : cinq sous unités de l'ATPase à protons de type vacuolaire ; une protéase à cystéine et une protéase de type cathepsine D ; l'actine ; une protéine de 25 kDa dont le rôle et la localisation sont encore à l'étude.
À partir des séquences partielles de ces protéines nous avons produit des anticorps polyclonaux. Ces anticorps ont montré que la plupart des protéines identifiées sont présentes très tôt dans les compartiments endocytaires. En parallèle, le matériel endocytaire purifié par fractionnement magnétique a été injecté à des souris en vue de la production d'anticorps monoclonaux. Un des anticorps monoclonaux obtenus est particulièrement intéressant. En effet il reconnaît une protéine membranaire localisée non seulement sur la membrane des vésicules d'endocytose mais aussi sur la membrane plasmique de l'amibe. L'identification et la caractérisation de la protéine reconnue par cet anticorps sont en cours. Grâce à l'identification des protéines endocytaires majeures et la production d'anticorps dirigés spécifiquement contre certaines protéines des vésicules d'endocytose. Nous avons d'une part répondu à un certain nombre de questions concernant la nature des protéines impliquées dans le processus endocytaire chez l'amibe Dictyostelium discoideum, et d'autre par produit des outils d'études. Nous désirons maintenant utiliser ces outils pour aller de l'avant dans la caractérisation du processus endocytaire chez cette amibe mais aussi dans d'autres systèmes cellulaires tels que le macrophage et le neutrophile.

Jury :
Président : M. Pierre Vignais
Rapporteur : M. Jean Gruenberg
Rapporteur : M. Jean-Pierre Henry
Examinateur : M. Jérôme Garin
Examinateur : M. Michel Satre

Mots-clés :
Microséquençage de protéines, identification de protéines, endocytose, Dictyostelium discoideum, V-H+ATPase, protéase à cystéine, cathepsine D, Rab7, actine.