​Par Giulia Franco
Équipe Génétique & Chemogénomique (Gen&Chem)

Un grand nombre de modifications épigénétiques ciblent les ARN messagers eucaryotes comme l’ajout d’une coiffe 5', d’une queue polyA ou de marques internes telles que la méthylation du cycle adénosine en position 6 (m⁶A). Ces modifications régulent la stabilité et l'activité traductionnelle des ARNm et constituent des niveaux essentiels de régulation de l'expression génique chez les eucaryotes.
Le premier chapitre de ma thèse porte sur l'étude de l’ARN méthyltransférase PCIF1 chez la mouche Drosophila melanogaster. PCIF1 se lie à l’ARN polymerase II (ARN Pol II) et dépose un groupe méthyl sur le cycle adénosine (m⁶Am) si le premier nucléotide transcrit est une adénosine. Chez la souris, l'absence de PCIF1 entraîne une perte de poids et une dérégulation de nombreux gènes dans plusieurs tissus, notamment dans le testicule. Chez la drosophile, Pcif1 est conservée mais une substitution d'un seul acide aminé inactive l'activité méthyltransférase. J'ai analysé les conséquences phénotypiques et moléculaires de mutants Pcif1 générés par la méthodologie CRISPR/Cas9 afin de déterminer les fonctions indépendantes de l’activité catalytique de Pcif1 chez la drosophile. J'ai montré que les mutants Pcif1 mâles et femelles présentaient une fertilité réduite. De plus, le séquençage des ARNm a révélé un ensemble de gènes dérégulés dans les ovaires mutants. J'ai également observé une suppression de la bigarrure de l’œil induite par effet de position (PEV) chez les hétérozygotes Pcif1/+ qui témoigne d’un effet sur l’expression du gène white. Des expériences complémentaires réalisées au sein du laboratoire du Pr E. Brasset ont révélé que Pcif1 se lie à l'euchromatine au niveau des bandes chromosomiques interphasiques correspondant aux gènes activement transcrits. L'ensemble de nos résultats montrent que malgré l'absence d'activité catalytique, Pcif1 est impliquée dans la régulation de l'expression génique chez la drosophile. Pcif1 pourrait agir comme modulateur au sein du complexe transcriptionnel, une hypothèse renforcée par le fait que Pcif1 se lie directement à la partie C-terminale de l’ARN Pol II.
Le deuxième chapitre de ma thèse est centré sur l'identification de structures alternatives de la coiffe et d'enzymes capables de les hydrolyser, conduisant à la dégradation des ARNm et au recyclage des nucléotides. La coiffe canonique consiste en une N7-méthylguanine (m⁷G-cap) qui est attachée au premier nucléotide transcrit des ARNm eucaryotes ; elle est hydrolysée par DCP2. DCP2 appartient à une grande famille d'hydrolases conservées au cours de l'évolution, la famille Nudix, qui comprend 22 membres chez les mammifères. Plusieurs structures de coiffe alternatives ont été identifiées chez des bactéries ou divers eucaryotes, telles que : le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), la flavine dinucléotide (FAD), le diphospho-coenzymeA (dpCoA) et le diadénosine-tétraphosphate (Ap4A), l’uridine diphosphate glucose (UDP-Glc) et l’uridine diphosphate N-acétylglucosamine (UDP-GlcNAc). Peu de données existent sur le rôle des membres de la famille Nudix et l’existence ou non de coiffes alternatives chez les eucaryotes supérieurs. Dans ce contexte, mon objectif était d'effectuer une analyse fonctionnelle de la famille Nudix chez la drosophile. En utilisant une approche de criblage génétique reposant sur l'expression d’ARN interférents de façon ciblée dans différents tissus, j'ai induit l’extinction de chacun des 12 gènes Nudix chez la drosophile. Mes travaux ont mis en évidence que les deux protéines Nudt19A et Nudt19B sont nécessaires à la fertilité normale des mouches. D’après leur séquence, ces protéines, qui sont étroitement apparentées, sont des hydrolases du Coenzyme A, une activité qui reste à confirmer expérimentalement. Nous avons généré des mutants CRISPR/Cas9 des deux gènes Nudt19A et Nudt19B, afin d'étudier plus en détail leur fonction dans la fertilité et leur rôle potentiel dans l’hydrolyse d’une coiffe alternative chez les eucarytes.