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Monika Pyzalska

Développement de microtechnologies et application à la culture cellulaire 3D pour étudier la formation d'acini prostatiques et la cancérogenèse

Publié le 17 octobre 2014
Thèse soutenue le 17 octobre 2014 pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Grenoble Alpes Spécialité : Biotechnologie, instrumentation, signal et imagerie pour la biologie, la médecine et l'environnement

Résumé :
Tout épithélium glandulaire sécrétoire est constitué d'une unité structurale et fonctionnelle commune, l'acinus. C'est une architecture sphérique pluricellulaire parfaitement différentiée et polarisée qui, reconstruite en culture 3D, mime l'organisation réelle du tissu. Etudier les déterminants environnementaux et génétiques qui gouvernent la transformation d'un acinus en sphéroïde s'apparentant à une tumeur est l'un des enjeux majeurs des modèles in vitro. Un des défis actuels est d'adapter ces modèles in vitro à des conditions de culture 3D qui soient compatibles avec la réalisation de cribles génétiques en 3D, basés par exemple sur l'ARN interférence (RNAi). Cependant, les formats standards de culture 3D et les méthodes analytiques ne sont pas compatibles aux cribles haut-débit. Ils ne permettent pas de contrôler la taille et la distribution des acini, sont dépendants d'immuno-marquages et les acquisitions sont longues. Par ailleurs, la microscopie confocale et vidéomicroscopie offrent un champ d'observation restreint qui ne permet pas d'observer un grand nombre de structures 3D en même temps, pour permettre une analyse statistique. Ainsi, dans le but i) de développer des modèles cellulaires appropriés en 3D, ii) d'adresser des questions fondamentales relatives au cancer de la prostate et iii) de réaliser des cribles RNAi dans un contexte plus pertinent que la culture 2D, j'ai développé des outils innovants au format microsystèmes adaptés à l'analyse haut-débit d'un grand nombre d'objets 3D. En optimisant les conditions de culture cellulaire 3D sur le modèle de la lignée cellulaire RWPE1, j'ai pu récapituler les étapes de formation des acini prostatiques et montrer que la formation du lumen est indépendante de la polarité et est gouvernée par deux mécanismes, « hollowing » et cavitation. Pour adapter la culture 3D au HTS, j'ai tout d'abord développé une approche de microfluidique basée sur l'encapsulation de cellules uniques. La microfluidique offre un contrôle précis du microenvironnement et de la taille de la capsule, qui rend possible l'analyse de la morphogenèse à l'échelle de la cellule unique avec une plus grande reproductibilité que les systèmes standards de cultures 3D. En ajustant les conditions de flux, l'intégration d'une seule cellule par capsule est favorisée, créant des micro-réacteurs 3D. J'ai pu montrer que chaque cellule épithéliale de prostate contenait des signaux intrinsèques suffisants qui, en combinaison des signaux du matrigel, permettent la différentiation d'un acinus. Par ailleurs, les capsules collectées dans du milieu de culture, deviennent faciles à manipuler en flux, pouvant être triées pour des applications de cribles. Afin d'imager ces structures 3D de façon rapide et sans marquage, j'ai aussi réalisé des acquisitions d'images par microscopie sans lentilles, en collaboration avec le CEA/LETI. J'ai montré qu'il est possible de discriminer des acini (structures creuses différentiées avec lumen) de sphéroïdes (structures pleines non différentiées s'apparentant à des tumeurs et sans lumen), sur la base d'une signature optique (holographique) spécifique. Cette méthode permet d'analyser à grande échelle les effets de siRNA sur la proportion d'acini et de sphéroïdes. Qui plus est, en réalisant des acquisitions sur 72 heures, nous avons été plus loin dans la compréhension du processus de développement de ces structures 3D et avons observé différents phénotypes dynamiques en 3D, similaires au processus de tubulogenèse. En conclusion, les technologies développées durant ma thèse permettent de contrôler et de standardiser des modèles cellulaires 3D. La microfluidique et l'imagerie sans lentilles ouvrent de nouvelles perspectives pour la réalisation de cribles haut-débit en 3D, la découverte de nouvelles molécules en oncologie et pour l'étude du développement et de la cancérogenèse.

Jury :​
Rapporteur : Séverine Le Gac
Rapporteur : Matthias Nees
Examinateur : Magnus K Magnusson
Examinateur : Joanne Young
Directrice de thèse : Nathalie Picollet D'hahan

Mots-clés :
Capsules polymériques, microenvironnement, culture cellulaire, différentiation, prolifération, microfluidique.

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