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Phénotypage cellulaire par imagerie automatisée

Publié le 6 février 2019



Activité de Recherche et Développement
Responsable Emmanuelle Soleilhac

Notre objectif est d'utiliser les outils d'imagerie quantitative et qualitative (ou HCS pour High Content Screening) pour la découverte de nouveaux composés bioactifs par criblage robotique et pour leur validation et leur caractérisation grâce à un phénotypage cellulaire poussé.


Le High Content Screening est une technique de criblage sur cellules vivantes ou fixées. Basé sur l'utilisation de microscopes en fluorescence, il permet la capture rapide et automatique de grandes quantités d'images de cellules marquées (vivantes ou fixées) ; des logiciels dédiés d'analyse d'images rendent possible l'extraction automatique de l'information biologique contenue dans chaque cellule (nombre de cellules, noyaux, structures subcellulaires, analyses morphologiques telles que aire, forme, texture …).

Depuis 2007, notre souhait a été de mettre en place une stratégie de phénotypage cellulaire afin d'accélérer la phase de validation et de caractérisation des composés bioactifs sélectionnés par criblage robotique sur notre plateforme. Différents tests phénotypiques sur cellules ont été adaptés au format des plaques 96 puits, permettant d'investiguer l'effet des petites molécules chimiques sur certains des constituants essentiels de la cellule (Figure 1). Pour chaque test expérimental, un protocole d'acquisition automatique d'images est développé en vue d'une utilisation en routine. La quantité de données générées est très importante et nécessite donc le développement et l'intégration de méthodes informatiques de segmentation d'objets (noyaux, cellules, organites cellulaires…), d'extraction de descripteurs spécifiques et de modélisation statistique.



Figure 1 : Stratégie de phénotypage cellulaire en HCS/HCA.

Adossé au projet de recherche de l'équipe Gen&Chem, nous appliquons notre stratégie de phénotypage par HCS à la recherche de composés prometteurs pour l'étude et la compréhension des mécanismes de régulation de l'inflammation et de l'immunité innée, et notamment à des composés ciblant les déubiquitinases, acteurs majeurs de ces processus biologiques. Ainsi les tests cellulaires permettant de quantifier la translocation nucléaire de NF-κB sous induction au TNFα ou d'évaluer l'autophagie (Figure 2) dans les cellules ont été utilisés dans des criblages de composés chimiques en vue d'identifier de nouveaux modulateurs chimiques (Projets en cours). Ces mêmes essais sont actuellement utilisés avec succès pour l'étude de de l'extinction génique par shRNA de certaines Ubiquitin Specific proteases, USPs.



Figure 2 : Test cellulaire pour la quantification de l'autophagie.
Des cellules HeLa exprimant la protéine LC3, marqueur spécifique des autophagosomes, couplée à la GFP ont été colorées avec du Hoechst pour la détection des noyaux. Les images des canaux de fluorescence Hoechst et GFP ont été acquises avec l’INCell Analyzer 1000 (objectif x20). Les images ont ensuite été analysées avec le logiciel INCell Investigator afin d’extraire de nombreuses informations quantitatives et qualitatives comme le nombre de cellules, d'autophagosomes, l’intensité de fluorescence de chaque marquage, la forme ou encore l’aire des noyaux, des cellules et des autophagosomes.


Depuis 2011, l'activité HCS de la plateforme a été ouverte aux utilisateurs de notre institut. Les modalités d'accès ainsi que le matériel disponible sont détaillés et expliqués dans une charte s'adressant aux utilisateurs.

Parallèlement, nous menons un projet collaboratif avec le Pr R. Nadon (Université McGill, Montréal, Québec) dont l'enjeu est de développer de nouvelles méthodes d'analyse statistique, originales, qui faciliteront la collecte de données fiables et l'analyse pertinente des effets biologiques. Ces méthodes devraient nous permettre ensuite de convertir plus facilement les informations biologiques visibles (dépolymérisation de microtubules, mort cellulaire, mitochondries endommagées…) en une série de descripteurs quantitatifs analysables statistiquement.

Savoir faire et collaboration. Quelques exemples.



Tests cellulaires pour des applications HCS/HCA.